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法医实验室几种常用DNA提取方法

时间:2022-02-10   访问量:1451


法医实验室几种常用DNA提取方法及比较


(一)Chelex100法

原理:Chelex100是一种螯合树脂,由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成,含有成对的亚氨基二乙酸盐离子,起着螯合基团作用,对多价金属离子有极强亲和力。在低离子强度、碱性及100℃煮沸条件下,可以使细胞膜裂解,并使与DNA结合的蛋白质变性,DNA游离。检材基质中一般含有大量金属离子,在低离子强度及加热条件下,金属离子可以辅助脱氧核糖核酸酶降解DNA,也可以抑制PCR反应,所以在提取DNA时,加入Chelex100,螯合了金属离子,防止了DNA降解,提高了PCR扩增成功率。


方法:剪取适量血斑、精斑、汗斑、鼻涕斑、指甲、毛根、软组织等等生物检材,置于0.5ml离心管内,加入适量纯水,室温浸泡,13,000rpm离心5min,上清丢弃,管底留约20μl左右液体及检材基质,加入100-200μl 5%Chelex100(有时需加适量PK)56℃15min至数10小时不等,100℃8min,13,000rpm离心5mim,上清备用。


评述:

1、 Chelex100法已经成为DNA提取的基本方法,Chelex100法是万能的。目前,我们一切纯化方法都在Chelex100法的基础上进行,Chelex100法又不是万能的。

2、 Chelex100法提取前的检材清洗非常重要,因为现场检材往往均较脏,脏东西可以抑制PCR反应,所以往往不止清洗一次,清洗检材时可能损失部分DNA。所以应平衡清洗抑制剂与损失DNA之间的关系。特别强调清洗时应“把根留住”,很多情况下已知样本DNA检验失败的原因是把根没有留住。DNA检验时还有另外一句名言:“一个萝卜一个坑”,防止混乱检材。肝素抑制PCR反应,血红素抑制PCR反应,所以长时的浸泡、多次清洗往往可能洗除肝素及血红素。在已知样本多次无检验结果疑为肝素抗凝的情况下,多洗是检验成功所必须的。血红素对普通Taq酶的抑制作用是明显的,而目前mtDNA扩增一般用普通Taq酶,所以同一样品除进行STR检验外尚需进行mtDNA检测时,尽量去除干净血红素,显得尤为重要。现场提取毛发或样本毛发,用毛根进行STR检验时,纯水清洗也非常重要,如果没有清洗干净,毛根DNA本身很少,很易检出为混合型。因为现场毛发及样本毛发很易粘附另一人成份。毛根清洗的特点为振荡洗涤,不离心,多换水。

3、 清洗后检材中加入5%Chelex100量视检材而定。 检材参考加入量

0.5×0.5cm血斑 150ul-200ul

二步法精斑 100ul

毛根 10ul

烟头 30-50ul

4、 对于组织,难溶检材,有疑问检材,均可加入终浓度为100ug/ml左右PK,有时间隔一段时间,补加适量PK,PK(蛋白水解酶K)作用最佳pH为8.0。

5、加入Chelex100后,56℃浸泡时间,血斑≥15min;组织≥30min,二步法精斑≥1h。

6、PCR扩增前应离心。PCR扩增时不应吸入Chelex100,因为Chelex100为PCR抑制剂。

7、Chelex100使用浓度5%,有些人用10%,有些人用20%,各人爱好。配制好5%Chelex100 pH应在10—11之间,否则应丢弃,不应人为调整Chelex100悬液pH值。


(二)有机法

原理:有机法提取DNA一般是指用平衡酚(又叫饱和酚)、氯仿等按不同比例混合,采用不同方法提取DNA。DNA易溶于水,不溶于有机溶剂,蛋白质分子表面带有亲水性基因,很容易进行水合作用,并在表面形成一层水化层,使蛋白质分子能够顺利地进入到水溶液中,形成稳定的胶体溶液。在有机溶剂存在的情况下,破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性,使蛋白质变性沉淀,离心后,有机溶剂于试管底层(有机相),DNA继续稳定的存在于上层水相,蛋白质沉淀存在于两相之间。水相中的DNA在大量冷无水乙醇及单价阳离子存在的情况下,水会溶于乙醇中,而DNA从水相中析出,沉淀,通过离心回收。有机法中常用试剂为平衡酚、氯仿,酚及氯仿作用是使蛋白质变性,氯仿的另一作用是有助于水相与有机相分离,并抽提溶于水中(有时达12%)的酚。平衡酚、氯仿及乙醇,三者互溶。

方法:剪取适量检材,置于0.5ml离心管内,清洗方法同用Chelex100法提取DNA,加入适量纯水及终浓度为100μg/ml PK,37℃-56℃孵育15min至数10小时,有时间隔一段时间补加适量PK → 13,000rpm 5min → 吸上清于另一管 → 加入等体积平衡酚 → 振荡或颠倒彻底混匀 → 13,000rpm 5min →吸上清水相于另一管,加入等体积1:1混合平衡酚:氯仿 → 振荡或颠倒彻底混匀 → 13,000rpm 5min → 吸上清水相于另一管 →加入等体积氯仿 → 振荡或颠倒彻底混匀 → 13,000rpm 5min → 吸上清水相于另一管 →加入2.5倍体积冷无水乙醇冷冻保存10min以上 → 13,000rpm 5-10min → 弃上清 → 室温凉干或100℃ 5min烤干 → 加入10-20μl纯水 → 室温溶解或100℃5min帮助溶解 → 离心上清备用

评述:

1、有机法是经典DNA提取方法,目前国内外仍大量采用,其提取DNA特点为双链,纯度高。

2、有机法缺点是应用有毒有机试剂,对人体有害,污染环境;多次换管,容易引起检材污染及编号混乱。有机法提取DNA的另一个缺点是不能去除某些染料,血红素等,而这些恰好是PCR抑制剂。


(三)磁珠法

原理:(异)硫氰酸胍(GuSCN)是强烈蛋白变性剂,不破坏蛋白质一级结构,能破坏细胞膜及核膜蛋白,并使核酸酶失活,释放DNA。磁珠可以特异性吸附DNA,与DNA结构及片段大小无关。通过洗涤液洗涤,在仅留有特异吸附DNA的磁珠中加入洗脱液,65℃解离后,DNA释放于洗脱液中。

方法:5%Chelex100提取DNA上清液或者用裂解液直接提取骨骼、指甲、毛发DNA上清液等约移于0.5ml离心管内 → 加入结合液100ul,磁珠5ul → 振荡混匀,室温5min → 在磁架上吸弃上清 → 加入洗涤液I 300ul → 振荡混匀 → 在磁架上吸弃上清 → 加入洗涤液II 300ul→ 振荡混匀 → 在磁架上吸弃上清 → 加入洗涤液II 300ul → 室温放置2 min干燥 → 加入30-50μl 洗脱液,振荡混匀 → 65℃ 10min → 速于磁架上吸上清于另一新离心管内,备用。

评述:

1、磁珠法优点是简便、快速,不使用有机溶剂,安全无毒。且经过笔者验证,磁珠法灵敏度非常高,于一根放置月余的带毛囊的毛发中成功提取到DNA且后期的STR分型检测中成功检测到19个位点。由此可见,磁珠法非常适用于微量及疑难检材的DNA提取。

2、磁珠法与离心柱法比较,前者简单、方便,转移离心管次数较少,不易污染,而后者则正好相反。

3、目前磁珠法已被广泛地用于法医DNA实验中,国内的品牌主要有洛阳惠尔纳米科技有限公司的法医样本DNA试剂盒,该品牌生产的磁珠稳定性、灵敏性均居于世界前列,与国外某些品牌相比提取和纯化效果也毫不逊色。


(四)盐析法

1988年Miller等报导经典盐析法提取血液DNA,其方法为溶解红细胞后,离心沉渣用PK消化,用大约6M饱和NaCl沉淀蛋白质,离心上清中DNA用无水乙醇沉淀,用TE溶解。


(五)NaOH法

原理:强碱溶解、变性蛋白质,破坏细胞膜及核膜,变性核酸酶,释放DNA,NaOH不破坏DNA一级结构。

方法:

1、试剂配制 裂解buffer 0.2M NaOH 中和buffer 0.04M Tris-HCL pH7.5

2、实验步骤 5μl或1×1mm血斑 → 加入450μl纯水 → 室温或37℃15-30min → 13,000rpm 5min → 弃上清 → 沉淀中加入20μl 0.2M NaOH(全血室温5min血斑75℃5min) → 加入180μl 0.04M Tris-HCL pH7.5 → 振荡混匀,离心上清备用

评述:

1、一般认为碱性法提取DNA的主要缺点是DNA保存于碱中不稳定,4℃放置24h后PCR扩增往往失败。NaOH法提取DNA STR检测不稳定(4℃保存24h后PCR为阴性)的主要原因是NaOH未完全破坏DNA酶及DNA与蛋白质重新结合。

2、碱性法提取DNA的局限性。烟头、邮票、口腔擦拭物、精斑、血斑、指甲等均可用碱性法提取,但是毛根、软组织等不能用NaOH法提取。


(六)五种DNA提取方法的比较

1、Chelex100法及碱性法的优点是DNA提取时间短,单管,检材不易污染,缺点是提取DNA纯度不高。碱性法与Chelex100法比较,前者成本更低,缺点是提取DNA保存时间短,室温不超过7天,4℃及冷冻保存84天后均无法成功检见Amel及STR位点。因为碱性法及Chelex100法均方便简单,提取DNA时间短,尤其适宜于建立DNA罪犯数据库及已知样本DNA检验。

2、有机法及磁珠法优点是提取DNA浓、纯,尤其适宜于特殊生物检材,微量疑难生物检材DNA提取。有机法缺点是提取过程复杂,耗时,多管,检材易污染,及有机试剂污染环境、伤害人体。磁珠法提取简单快捷,安全无毒,且无需频繁移管,检材污染可能性小,尤其适用于微量检材。而且可配合工作站进行全自动操作,大大提高了提取的效率。

3、盐析法的优点包括便宜,不用有机试剂。缺点是不易提取微量检材。


(七) DNA提取几种常用试剂作用及浓度

1、PK 破坏蛋白质一级结构,使蛋白质成碎片,贮存浓度一般为5mg/ml,使用终浓度一般为100μg/ml,有时提取骨骼DNA的PK终浓度达5.5mg/ml。PK最佳pH值为8.0。

2、SDS 既是蛋白变性剂又是表面活性剂(去垢剂),有变性蛋白质及保护蛋白质的双重作用,所以可以理解PK与SDS混用而不会破坏PK的原因。贮存液浓度10%,使用终浓度一般为1%。Triton、Tween与SDS作用相似。

3、EDTA 能螯合金属离子,防止脱氧核糖核酸酶降解DNA。


引:

作者:weixinsuoxian

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